Protocol for Harvest, Transport and Storage of Human Osteochondral Tissue / Protocolo para captação, transporte e preservação de tecido osteocondral humano

Abstract Objective To elaborate a protocol for the harvest, transport, and preservation of human osteochondral tissue for use in tissue banks (TBs). Methods Osteochondral fragments measuring 2 cm3 of 5 corpse donors aged between 15 and 45 years old were analyzed. The samples were stored in cell preservation medium containing: human albumin, Iscove's and vancomycin preserved at 4ºC. The concentration of proteoglycans in the extracellular medium was quantified by the use of Safranin-O, while tissue structural analysis was assessed by histological study with hematoxylin-eosin stained slides. The images obtained were analyzed according to the histological scores of Mankin and the score proposed by the OsteoArthritis Research Society International. The samples were analyzed with 0, 15, 30 and 45 days of preservation. Results The osteochondral fragments studied showed a progressive decrease in proteoglycan concentration with increased preservation time. After 30 days of preservation, structural changes were identified with discontinuity of the cartilage surface layer. According to the results obtained by the Mankin score, there was a statistically significant difference between 15 and 30 days of tissue preservation. Conclusion The protocol described defined knee transport immersed in Lactated Ringer at a controlled temperature of 10º C until its arrival at the TB. After processing, the preservation solution was composed of Iscove's serum-free cell culture medium supplemented with 10% human albumin and 100 µg/ml vancomycin. The tissue was preserved at a temperature of 4ºC until the moment of transplantation characterizing the fresh preservation.

Resumo Objetivo Elaborar um protocolo para a captação, transporte e preservação de tecido osteocondral humano para utilização em banco de tecidos (BT). Métodos Foram analisados fragmentos osteocondrais com dimensão de 2 cm3 de 5 doadores cadáveres com idades entre 15 e 45 anos. As amostras foram armazenadas em meio de preservação celular contendo: albumina humana, Iscove's e vancomicina preservados à temperatura de 4ºC. A concentração de proteoglicanos no meio extracelular foi quantificada pelo uso de Safranina-O, enquanto a análise estrutural do tecido foi avaliada através de estudo histológico com lâminas coradas em hematoxilina-eosina. As imagens obtidas foram analisadas segundo os escore histológicos de Mankin e o escore proposto pela OsteoArthritis Research Society International. As amostras foram analisadas com 0, 15, 30 e 45 dias de preservação. Resultados Os fragmentos osteocondrais estudados apresentaram diminuição progressiva na concentração de proteoglicanos com o aumento do tempo de preservação. Após 30 dias de preservação, foram identificadas alterações estruturais com descontinuidade da camada superficial da cartilagem. Segundo os resultados obtidos pelo escore de Mankin, houve diferença com significância estatística entre 15 e 30 dias de preservação do tecido. Conclusão O protocolo descrito definiu o transporte de joelho em bloco imerso em Ringer Lactato em temperatura controlada a 10ºC até sua chegada ao BT. Após o processamento, a solução de preservação foi composta por meio de cultura celular sem soro Iscove's suplementado com albumina humana a 10% e vancomicina 100 µg/mL. O tecido foi preservado à temperatura de 4ºC até o momento do transplante caracterizando a preservação a fresco.

Protocolo para a captação, transporte e armazenamento de tecido osteocondral humano / Evaluation of the protocol for harvest, transport and storage of human osteochondral tissue

O tratamento das lesões osteocondrais representa um desafio ao cirurgião ortopédico. Diversas técnicas biológicas visam a restauração do tecido lesionado, estando limitadas a formação de fibrocartilagem ou a dimensão da área a ser restaurada. O transplante alógeno osteocondral representa o único método biológico capaz de fornecer cartilagem hialina para o tratamento das lesões maiores que 2cm². A viabilidade celular do tecido no momento da cirurgia representa um fator indispensável para que haja sucesso no tratamento. A ausência de um protocolo definido pelos órgãos reguladores de saúde nos levou a necessidade de elaborar uma metodologia própria para captação, transporte e armazenamento de tecido osteocondral humano. Foram analisados fragmentos osteocondrais com dimensão de 2cm³ de cinco doadores cadáveres com idade entre 15 e 45 anos. As amostras foram armazenadas em meio de preservação celular contendo: albumina humana, Iscove's e vancomicina preservados à temperatura de 4°C. A concentração de proteoglicanos no meio extracelular foi quantificada pelo uso de Safranina-O, enquanto a análise estrutural do tecido foi avaliada através de estudo histológico com lâminas coradas em hematoxilinaeosina. As imagens obtidas foram analisadas segundo os escore histológicos de Mankin e o escore proposto pela OsteoArthritis Research Society International. As amostras foram analisadas com 0, 15, 30 e 45 dias de preservação. Os fragmentos osteocondrais estudados apresentaram diminuição progressiva na concentração de proteoglicanos com o aumento do tempo de preservação, soretudo na camada de superficial da cartilagem. Após 30 dias de preservação foram identificadas alterações estruturais com descontinuidade da camada superficial da cartilagem. As demais camadas do tecido osteocondral mantiveram suas estruturas preservadas após 45 dias de preservação. Segundo os resultados obtidos pelo escore de Mankin, houve diferença com significância estatística entre 15 e 30 dias de preservação do tecido. Os resultados encontrados definiram o protocolo de preservação transporte e armazenamento de tecido osteocondral humano a ser aplicado pelo Banco de Tecidosmultiesquelético lotado no Instituto Nacional de Ortopedia e Traumatologia.

The treatment of osteochondral lesions remains a challenge to the orthopedic surgeon. Various biological techniques aim at the restoration of the injured tissue, being limited the formation of fibrocartilage or the size of the area to be restored. The allogeneic osteochondral transplantation represents the only biological method capable of providing hyaline cartilage after lesions larger than 2cm². The cellular viability of the tissue at the time of surgery is an essential factor for successful treatment. The absence of a protocol defined by the health regulatory agencies has led us to the need to develop a proper methodology for harvest, transporting and storing human osteochondral tissue. Osteochondral fragments measuring 2cm³ of five cadaveric donors aged between 15 and 45 years were analyzed. The samples were stored in cell preservation medium containing: human albumin, Iscove's and vancomycin maintained at 4 ° C. Immunohistochemical study with antibodies to the Caspase 3 protein evaluated the presence of cell death by apoptosis. The concentration of proteoglycans in the extracellular matrix was quantified by the use of Safranin-O, while tissue structural analysis was assessed by histological study with hematoxylin-eosin stained slides. The images obtained were analyzed according to the histological scores of Mankin, OsteoArthritis Research Society International and the score proposed by the authors. The samples were analyzed with 0, 15, 30 and 45 days of preservation. The samples studied presented a progressive decrease in the concentration of proteoglycans with the increase of preservation time. After 30 days of preservation, structural changes were identified in the superficial layer of the cartilage. The remaining layers of the osteochondral tissue maintained their structures preserved after 45 days of preservation. According to the results obtained by the Mankin score, there were differences with statistical significance between 15 and 30 days of preservation. The results found defined the protocol for the preservation of the transport and storage of human osteochondral tissue to be applied by the Bank of Tissues, located in the National Institute of Orthopedics and Traumatology